丹参素调控自噬以减少缺血再灌注损伤述评
孙大伟1,2，齐新2，高青1
1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津市人民医院，天津 300121
摘要：通过Langendorff系统复制离体心肌缺血再灌注损伤模型，采用丹参素进行药物干预，探讨丹参素在治疗离体大鼠心脏缺血再灌注损伤中，自噬对心功能、ROS、能量代谢、凋亡的影响，可以明确验证药物干预的作用靶点和机制。前期基础研究表明：浓度为10μM丹参素溶于KH灌流液中可以明显改善缺血再灌注损伤大鼠（稳定后停灌30min，复灌60min）的左室发展压（left ventricular developed pressure,LVDP）。丹参素是否通过Sirt1蛋白而影响缺血再灌注损伤中自噬相关通路,抑制ROS，有待后续进一步验证。丹参素来源于传统中药丹参，具有广阔的应用前景和发展空间。随着中医药在细胞自噬研究方面的不断深入，寻找有效的中药，通过调节自噬途径来治疗疾病并揭示其作用靶点，将是中医药领域的最新热点。
关键词：丹参素；自噬；能量代谢；缺血再灌注；Sirt1-FoxO1-Rab7
近年来，随着生活水平的提高，缺血性心肌病患病率逐年上升。美国心脏协会一项关于1980-2010年全球缺血性心脏病版图变迁的研究显示：2010年，缺血性心肌病居全球死亡原因的第一位，全球缺血性心肌病死亡人数呈明显上升趋势[1]。缺血性心肌病可引起急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI），且病死率与缺血时间密切相关，缺血吋间越长，梗死面积越大，患者预后越差。随着经皮冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路移植术的大量开展，以及手术和麻醉技术的不断进步，再灌注措施在临床上的广泛应用为AMI患者带来了新的希望，成为当前AMI治疗指南的首选。然而，患者在再灌注过程中会出现一系列使缺血心肌损害更加严重的现象，即缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,I/R）。I/R损伤导致细胞凋亡，并诱发心肌收缩力下降、再灌注心律失常等严重并发症。再灌注造可成严重的心律失常如室性心动过速和室颤，而室颤能引起心功能急剧紊乱而致死[2]。因此防治I/R损伤，明确缺血再灌注损的发生机制是目前需要亟待解决的问题[3]。然而，迄今为止，I/R损伤的分子、细胞机制仍未彻底明了。研究表明I/R损伤的机制主要包括活性氧簇生成增加、钙超载、炎症反应、线粒体损伤、细胞凋亡、内皮细胞活化、自噬等[4]。其中自噬是目前研究的热点，被认为在心肌I/R损伤中发挥着非常重要的作用。
1 自噬可抑制缺血再灌注损伤中活性氧簇的产生
心肌氧气供应是否充足直接影响到能量代谢的方式，正常情况下脂肪酸氧化是心肌能量来源的主要途径。组织氧含量直接决定了能量来源物质糖脂的代谢方式，进而影响能量生成[5]。在缺血期，心肌细胞始终伴随着能量代谢的变化，包括代谢底物利用障碍、产能结构及耗能结构的变化。心肌缺氧时，耗能增加、能量储存减少、代谢产物的大量堆积都会加重缺氧心肌细胞的损伤[6]。复灌时线粒体是IR损伤最早受累的细胞器，线粒体功能障碍会进一步加重IR损伤。近期研究表明，线粒体通透性转换孔（MPTP）的开放是导致线粒体功能障碍的关键环节[7]。缺血时线粒体内TCA循环存在致大量的琥珀酸堆积，而复灌后琥珀酸大量氧化是导致大量ROS产生的罪魁祸首。当心肌长时间缺血再灌注时，Ca2+浓度升高、PH值增大、膜电位降低，同时堆积的琥珀酸迅速氧化导致大量ROS的产生，并导致线粒体渗透性转换孔（MPTP）的开放，过度的开放导致心肌细胞凋亡[8]。因此，如何减少ROS的产生，抑制MPTP的开放是缺血后处理心肌保护的关键药物靶点，其作为防治IR损伤的有效策略，目前已经得到公认。
研究表明：自噬可以通过多种机制抑制ROS的产生，减少IR损伤[9]。自噬对维持心肌正常功能具有重要作用，大鼠自噬相关基因Atgs被敲除后可致心功能严重混乱，心肌收缩力下降，心室结构发生改变，这与线粒体内聚集和肌小节去组织化有关[10]。另外，自噬在心肌缺血缺氧情况下可以通过提供代谢底物，改善能量代谢等途径来满足心肌的能量需求，从而保护受损的心肌。心肌缺血阶段随着ATP消耗殆尽，此时心肌细胞可诱导自噬的发生，自噬通过降解胞内物质，如无功能的胞浆蛋白和细胞器，产生氨基酸和脂肪酸为机体提供能量，维持心肌收缩力，同时抑制凋亡，从而发挥细胞保护作用[11]。Zhou J[12]等发现通过调控自噬可以对抗氧化应激，减少ROS的产生，表明自噬在保护心肌方面扮演重要角色。Yan W[13]等认为调控自噬可以改善慢性注射血管紧张素Ⅱ诱导大鼠严重心肌肥厚和纤维化，其机制可能与抑制ROS有关。Sishi BJ[14]等研究了自噬对阿霉素诱导大鼠心肌毒性的影响，证实了通过上调自噬，具有改善线粒体功能，抑制凋亡，清除ROS等作用，也可以促进受损的心肌细胞存活，并削弱阿霉素诱导的心肌细胞毒性。Ma X[15]等认为通过调控自噬相关蛋白beclin-1表达，能够有效恢复缺血再灌注损伤中线粒体正常的膜电位，从而阻止缺血再灌注诱导的心肌细胞死亡，同样与抑制ROS的产生相关。
2 自噬受Sirt1-FoxO1-Rab7通路的调节
1963年比利时科学家Christian de duve首先提出自噬的概念，自噬是一种进化上高度保守的降解细胞内大分子物质和细胞器的生理现象[16-17]。自噬广泛存在于真核细胞内，目前根据发生过程分为小自噬、巨自噬以及分子伴侣介导的自噬，而巨自噬现象最为普遍，系我们通常所指的自噬。自噬是一个利用双层膜包裹自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，以实现细胞稳态和细胞器的更新[18]。自噬在机体细胞发育、蛋白合成、组织重塑及环境适应等方面发挥着极其重要的作用，通过满足细胞必要的能量需求和合成反应，从而保护机体应对各种应激状况[19]。自噬在缺血心肌细胞中抗凋亡作用显著[20]，缺血、缺氧、线粒体功能障碍、感染等均可以诱导自噬水平的增加，此时细胞启动自噬机制来抑制凋亡，吞噬受损细胞器，合成能量，发挥心肌保护作用。自噬广泛存在于衰老的心肌细胞中，尤其在I/R损伤中细胞表现出强烈的自噬特性［21-25］。以上事实说明: 缺氧诱导的自噬多是以一种保护机制而存在的，机体通过自噬修复而来的氨基酸和脂肪酸可被利用来产生能量是改善心肌细胞能量代谢的重要调节机制。
为了更进一步明确自噬在缺血再灌注损伤中保护心肌细胞的作用机制，针对自噬相关信号转导通路分子机制的研究意义重大。明确自噬相关信号转导通路机制，有助于选择适当的干预靶点，充分发挥自噬调控，改善受损细胞能量代谢，促进心肌细胞存活，进而能够采取有效措施进行预防和治疗。研究表明乙酰化作用是新陈代谢中重要的调节机制[26]，并且自身也受新陈代谢变化的调控。研究发现[27-30]，心肌细胞在营养剥夺后，细胞中沉默信息调节蛋白1（silent information regulator protein 1,sirt1）和叉头转录因子O亚型1(forkhead box O1，FoXO1)均上调，并且Sirtl使FoXO1去乙酰化，并激活后者，增强饥饿状态下的细胞自噬。这可以证明细胞自噬的增强在一定程度上稳定了营养缺乏的心肌细胞[31]。研究表明[19]Sirt1介导FoxO1去乙酰化，进一步介导自噬体-溶酶体融合，增强细胞的自噬。乙酰化是重要的翻译后修饰过程，通过分化乙酰化自噬蛋白Rab7等促进自噬体的形成，是Sitr1信号通路参与自噬调控的直接途径。在缺血再灌注损伤中，Sitr1的激活与表达可以有效抑制ROS的产生，对抗凋亡，保护心脏[9]。因此Sirt1-FoxO1-Rab7通路的激活是自噬过程的关键环节，Sirtl可通过激活FOX01,上调自噬蛋白Rab7来调控自噬，发挥抑制ROS的作用，从而保护复灌时能量代谢出现障碍的心肌细胞。
沉默信息调节蛋白家族是哺乳动物中的一类高度保守的蛋白家族，包括Sirt1-7。Sirt1是Sirt蛋白中最早发现也是目前为止研究最为深入的蛋白，具有尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD）依赖的第3类组蛋白/非组蛋白去乙酰酶活性[32-35]。
叉头框基因1（FoxO1）：叉头框基因于20世纪90年代被首次发现。目前已发现有90多个Fox基因都具有Forkhead保护区，大约由100个氨基酸组成，称为“叉头框”。FoxO1广泛存在于从酵母到真核生物的哺乳类中，形成了一个庞大的转录因子家族[36-40]。FoxO1蛋白在抑制ROS、拮抗氧化应激、DNA损伤修复、调节能量代谢、延长寿命等生理、病理过程中发挥重要作用[19]。
Rab7（Ras相关蛋白7）是GTP 酶家族成员之一,Rab7 蛋白是自噬体和内体转变的关键参与者，包括从早期到晚期过渡、成熟化、运输负荷及最终与溶酶体融合。因此，Rab7可能是治疗异源物质清除障碍性疾病的潜在靶点，成为研究热点。目前认为各个Rab7基因在自噬的发生发展过程中发挥着不同的作用，部分参与自噬体的运输，部分参与自噬体的形成，部分参与自噬溶酶体的形成,各自相互配合，共同完成自噬的全过程。
FoxO1受上游Sirt1信号通路的去乙酰化调控，而FoxO1又可上调自噬蛋白Rab7的活性。由此可见Sirt1-FoxO1-Rab7信号通路是在缺血再灌注环境下诱导自噬，保护复灌时心肌细胞的关键环节。
3 丹参素调控自噬，抑制凋亡的作用机制
自噬具有双面性，早期适度自噬利于清除损伤的细胞器，对心肌细胞起保护作用，抑制或延缓凋亡的产生；后期自噬对机体有害，可导致自噬性死亡，此现象又被众多学者称为Ⅱ型凋亡。自噬性死亡与凋亡主要有以下区别：调亡以核的浓缩、核膜裂解及DNA片段化，并以凋亡小体产生和切冬酶激活为重要特征，最终被巨噬细胞所吞噬。而自噬性死亡则在胞浆中形成特殊的自噬体和自噬溶酶体；通过使用特异性凋亡抑制剂和自噬抑制剂同样可以将两者区分开，如机体细胞程序性死亡未被caspase抑制剂所阻止，却被自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤所抑制，这证明是自噬性死亡。如果可以增加适度自噬的时间窗，延缓或阻止自噬性死亡的发生，这势必成为药物抗凋亡的有效作用靶点之一。研究表明[41]:丹参素可以通过调节自噬相关通路 PI3K/Akt增强机体的抗氧化应激能力，并通过调节凋亡基因 Bax、Bcl-2的比值对抗凋亡，从而发挥心肌保护作用，这可能与丹参素抑制自噬性死亡有关。
4 丹参素的临床功效和实验效果
冠心病、心绞痛、心肌梗死属于中医胸痹、真心痛范畴,传统中医理论认为，血脉瘀滞是真心痛的重要病机[42-45]。临床上患者常有瘀血表现，如口唇发绀、头痛如刺、胀痛、脉弦细、细涩、舌质紫暗等，且表现出不同程度的血液流变学参数及微循环异常，其主要病理变化以血瘀为典型病症。目前胸痹病性属本虚标实已得到中医学者的公认，本虚主要包括气虚、阳虚，而心气虚为本，随着疾病的进展或失治误治，气虚日久可致阳虚，虚则不能推动血液运行，血行迟滞而成疲，不通则痛，发为胸痹。中医认为，胸痹的治疗关键在活血祛瘀。丹参是祖国传统医学中应用最广泛的药物，具有活血化瘀、温经止痛、宁心安神的功效，疗效确切、作用广泛，也是目前临床上应用最多的中成药。丹参素是现代先进生产工艺从传统中药丹参中分离提纯的一种高纯度芳香酸类化合物，是丹参的水溶性成分，也是其最重要的有效成分，广泛应用于各种研究。
大量研究证明丹参素具有抗动脉粥样硬化、保护心肌、抗氧化、抗纤维化、抗凋亡、清除氧自由基以及钙离子拮抗的作用。Li H等近期观察到丹参素联合丹皮酚可提高丹皮酚在心脏和脑组织中的分布[46]，同时能够增强在心肌缺血再灌注损伤过程中的药物功效[47]。陈维中[48]等通过动物实验表明，丹参素钠注射液可通过显著提高心肌收缩性能来发挥正性肌力作用，从而增强心脏泵血能力以及提高心输出量。张琳[49]等发现丹参素可以调节心肌组织缺血再灌注后乙酰CoA／CoA比值，表明丹参素可以抑制病理状态下心肌脂肪酸的氧化，并且可以改善病理状态下心肌的能量代谢，从而保护缺血再灌注心肌。Wu L[50]等用大鼠小冠脉结扎实验性心肌梗死模型，考察丹参素对心肌的保护作用。结果显示丹参素可能通过清除自由基、稳定细胞膜、保护缺血心肌膜损伤等作用机制起到对梗死心肌保护的作用。
5 小结
以上提示丹参素具有清除氧自由基、改善心肌线粒体的作用，但具体作用机制尚未明确。自噬同样可以减少ROS的产生，改善心肌细胞能量代谢，那么两者之间是否有什么关联呢？文献和我们以往的研究工作表明:丹参素可能是基于Sirt1-FoxO1-Rab7通路，调控自噬，抑制ROS，改善心肌能量代谢，发挥心肌保护作用，从而治疗缺血再灌注损伤。离体心脏灌流系统（Langendorff）是模拟心肌缺血再灌注并直接观察心脏功能状态的最佳研究工具。因此，通过Langendorff系统复制离体心肌缺血再灌注损伤模型，采用丹参素进行药物干预，探讨丹参素在治疗离体大鼠心脏缺血再灌注损伤中，自噬对心功能、ROS、能量代谢、凋亡的影响，可以明确验证药物干预的作用靶点和机制。前期基础研究表明：浓度为10μM丹参素溶于KH灌流液中可以明显改善缺血再灌注损伤大鼠（稳定后停灌30分，复灌60分）的左室发展压、冠状动脉流量、心率。丹参素是否通过Sirt1蛋白而影响缺血再灌注损伤中自噬相关通路,抑制ROS，有待后续进一步验证。丹参素来源于传统中药丹参，具有广阔的应用前景和发展空间。随着中医药在细胞自噬研究方面的不断深入，寻找有效的中药，通过调节自噬途径来治疗疾病并揭示其作用靶点，将是中医药领域的最新热点。
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基金项目：天津中医药大学中西医结合学院研究生创新基金（编号:ZXYCX201502）
作者简介：孙大伟（1987-)，男，河北秦皇岛人，博士研究生。
通信作者：齐新，Email：qixinx2011@126.com