温燥与肺炎支原体感染相关性研究
吴振起1，2，马融1，王贵帮3，平静2，王思源2，岳志军2，刘芳2
1.天津中医药大学，天津 300193；2．辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032；3． 辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110033
摘要:目的:通过观察温燥、肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae ，MP) 感染对BALB/c 小鼠肺组织病理炎症和肺组织水通道蛋白5(PulmonaRy tissue aquapoRin 5，AQP5) 的表达影响，比较温燥与MP 感染引起肺部炎症的相关性。方法: SPF 级BALB/c小鼠72只，雌雄各半，随机分为正常组24只，温燥组24只，MP 感染组24只，分别进行相关造模。于造模后第3天、第7天、第10天、第14天进行取材，对小鼠肺组织病理炎症程度进行评分，用实时荧光定量PCR 法(RT－PCR) 检测AQP5 mRNA 在小鼠肺组织内的表达，用免疫组织化学法(SP法) 和蛋白免疫印迹法( WesteRn Blot) 检测AQP5 的蛋白表达。结果:与正常组比较，温燥组和MP 感染组小鼠的肺组织AQP5的阳性表达率、AQP5mRNA的表达量及AQP5蛋白的表达量较正常组均明显降低，且有统计学意义(P<0． 05) ，且于观察时间点造模后第3天开始下调，于第7天、第10天达到低值范围，于第14天开始回调，同期光镜下观察到温燥组和MP 感染组小鼠肺组织均有肺泡水肿与肺泡隔增厚以及炎性细胞浸润表现，且病理积分呈现与第3天开始升高，到第7天、第10天达到最高范围，继而第14天开始下降，与病理表现于第3天开始炎症改变加重，第7天、第10天改变最为明显，第14天开始恢复改变同步。结论:不同检测方法一致性提示温燥条件下和MP 感染后均能引起肺组织AQP5 表达的下调，这与外燥伤肺，与肺部AQP5蛋白表达下降的结论一致。
关键词: 儿童肺炎；温燥；肺炎支原体；AQP5；小鼠
肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae，MP)具有广泛致病性，是儿童肺炎重要病原体之一，MP 感染的特征性症状是干咳，正如燥邪侵体以肺为病变、以耗伤津液为致病特征，相关研究证实AQP5 蛋白的表达与外燥伤肺耗津的病机有关[1]。笔者前期以“从燥论治”为理论，进行的相关研究表明，从燥论治MP 感染具有一定效果[2]。本研究通过造模温燥环境型小鼠和造模MP感染型小鼠，应用肺组织炎症程度进行评分、免疫组织化学、WesteRn Blot 和RT－PCR技术检测小鼠肺组织中的AQP5 蛋白及AQP5mRNA 的表达，比较各组小鼠肺组织病理改变及AQP5表达情况，从而为“从燥论治”小儿肺炎支原体感染提供生物指标依据。
1 材料与方法
1.1 MP 菌株MP 标准株FH 由辽宁中医药大学附属医院病毒室保存。将冻存的MP 接种至液体培养基中，并在37 ℃，含体积分数5% CO2、饱和氮的厌氧培养箱中孵育，培养液颜色由红变黄时进行连续传代，取第三代。MP 菌力及浓度的判定往往借助于颜色改变单位(colouR change unite，CCU) 的测定，以培养基由红色变为黄色时的最高稀释度作为CCU，采用CCU·mL － 1方法测定MP 浓度，取菌液浓度1×107CCU·mL － 1备用。
1.2 实验动物 SPF 级BALB/c 小鼠72只，体质量(20±2)g，雌雄各半，购买于辽宁长生生物技术有限公司( 辽宁省实验动物资源中心) ，生产合格证号: SCXK( 辽) 2013—009，使用合格证号: SYXK( 辽) 2015 －0001。
1.3 仪器与试剂
1.3.1主要仪器及设备 PQX － 300 人工气候培养箱(常州华冠仪器制造有限公司)；II级生物安全柜(美国BakeR 公司，型号: SG403 TXCE)；精密转轮切片机( RM2135，德国，Leica)；倒置荧光显微镜(OlympusBX50)；系统生物显微镜(BX50F4，日本，Olympus)；漂烘处理仪(ZMN － 6802，常州市华利电子公司)；俞式压力蒸汽灭菌器( 沈阳盛达生物电子设备有限公司)；AR2140 电子分析天平( 上海奥豪斯公司)；电热恒温干燥箱(GZX－DH．400－S－II，海跃进医疗仪器厂)；电热鼓风干燥箱(101 － 0A，天津泰斯特仪器有限公司)；超纯水机(Milli－Q，美国MillipoRe)；低温冰箱(MDF－382E， 13 本Sanyo)；低温高速离心机(德国HeRaeus，Biofuge 28RS)；电动玻璃匀浆机(DY89－I，宁波新芝科器研究所)；超声波细胞粉碎机(JY92－II，宁波新芝科器研究所)；蛋白－核酸分析仪(DU－600，美国Beckman)；PCR 仪(PE－9600，美国PeRkinElmeR)；电泳仪( EPS－300，上海天能) 。
1.3.2 免疫组织化学试剂 羊抗鼠AQP5 多克隆抗体、生物素化兔抗羊二抗试剂盒、DAB 色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，生产批号: 2009年5月)；PBS 缓冲液、蒸馏水、中性树胶、苏木素、枸橼酸缓冲液等。
1.3.3 RT － PCR 试剂 TRizol 总RNA 提取试剂(批号: 1304078， InvitRogen 公司)；氯仿(批号:2001年4月1日)；异丙醇(批号:0980507)；DEPC(批号:BB109I6S03) 、PRimeScRiptTM RT Reagent (批号:BK2001) 、SYBR． PRemix Ex TaqTM(批号: BK9106) 均由宝生物工程( 大连) 有限公( TaKaRa) 生产。
1.3.4蛋白印迹法试剂 总蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、鼠抗GAPDH 抗体和兔抗鼠AQP5抗体( 博士德生物工程有限公司，武汉) 。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组 依据随机数字表法，将72 只SPF 级BALB/c小鼠随机分为3组，分别为: 正常组24只、温燥组24只、MP 感染组24只。
1.4.2 模型复制 除正常对照组外，各组均造模。正常组存放于无菌常湿常温室中；将温燥组小鼠置于人工气候培养箱(PQX－300) 中，调整温度(22±2)℃、湿度(33±2) ℃、风速2.5m·s-1，模拟温燥环境[3]，每次取材时取出相应数量小鼠；MP感染组于乙醚轻度麻醉下，滴鼻接种1×107 CCU·mL-1 的MP 菌液，每只100 μL，连续3天，用微量加样器缓慢滴入鼻腔MP 菌液，进入气管支气管；接种后持小鼠呈45°静置30 s，以利于菌液充分吸入并防止窒息，造模后每日观察各组小鼠的体质量、进食、大便、活动度等情况变化。
1.4.3 标本取材 分别于造模后第3天、第7天、第10天、第14天，将每组小鼠，颈椎脱臼处死取材。无菌开胸，取出整个肺脏，观察并记录肺组织病变程度；取左侧肺叶用质量浓度40 g·L － 1多聚甲醛固定待做病理切片检查、免疫组织化学；右侧肺中、下叶用于RT－PCR 检测，右侧肺上叶用于蛋白质免疫印记法检测。
1.4.4 肺组织病理评分及肺组织炎症观察 根据文献［4］方法，对各组小鼠进行肺组织病理学评分。光镜下观察肺组织病理改变情况。
1.4.5 SABC 免疫组织化学染色法检测肺组织AQP5 蛋白表达AQP5 免疫组织化学检测操作按照试剂盒说明进行，采用BI2000 数字图象分析系统对染色结果进行分析。阳性结果判断: 以病变部位细胞上出现棕黄色颗粒为阳性表达。
AQP5 表达阳性率= 肺组织性染色光密度面积/肺面积组织总面积× 100%
1.4.6 RT － PCR 法检测肺组织的AQP5 mRNA 表达 总RNA 提取: 总RNA 经蛋白核酸分析仪测定A260 和A280 值，计算总RNA 含量。逆转录cDNA:取总RNA1μL 加入20μL 的反转录体系AQP5、GAPDH 引物，AQP5 根据文献［5］设计，上游引物:5'－GGC TGC AAT CCT CTA CTT CTA C－3'，下游引物: 5'－TTC TTC CGC TCC TCT CTA TGA－3'，扩增特异片段长度为127 bp；内参是GAPDH( 三磷酸甘油醛脱氢酶) ，上游引物: 5' －ACC ACC ATG GAG AAG GCT GG － 3'，下游引物: 5'－CTC AGT GTA GCC CAG GAT GC － 3'，扩增特异片段长度为528 bp。AQP5、GAPDH 引物均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。结果处理方法: PCR 反应40 个循环。以GAPDH 为内参照基因，应用目的基因法，比较目的基因与对照基因的比值，目的基因量= 2－△Ct，其中Ct是荧光达到阈值的循环数，△Ct = Ct 目的基因－ Ct 管家基因[6]。
1.4.7 WesteRn Blot 法检测肺组织的AQP5 蛋白质表达 按照总蛋白提取试剂盒说明书提取肺组织蛋白；按照BCA蛋白定量试剂盒说明书检测蛋白浓度，制定标准曲线；制胶，蛋白样品变性，上样，电泳，转膜( 半干式，45 min) ，质量浓度50 g·L － 1 脱脂奶粉封闭(2 h) ，滴加一抗，4℃孵育过夜，TBST 漂洗(10 min × 3 次) ，滴加二抗，37 ℃ 摇置孵育1 h，TBST 漂洗(10 min×3 次)，滴加ECL 工作液、显影、定影。Quantity One 图像分析软件进行密度分析，计算灰度值，目的蛋白的灰度值除以内参GAPDH 的灰度值以校正误差，所得结果为目的蛋白的相对含量。
1.5 统计学方法 采用SPSS 20． 0 统计软件，计量资料以均数± 标准差(x±s) 表示，统计方法采用单因素方差分析，组间比较采用LSD 检验。检验水准为α= 0.05。
2 结果
2.1 各组小鼠一般状态比较 正常组的小鼠状态活泼无异常，反应灵敏，呼吸平稳，毛色光亮，鼻腔没有明显的分泌物，没有明显呼吸系统疾病的特征。温燥组的小鼠于造模后2～3天开始出现亢奋不安、躁跃多动、呼吸急促现象，摄食和饮水量有所增加，
鼻腔有分泌物，尤以第7天之后加重。MP 感染组从第3天起出现了较为明显的症状，大多数的小鼠出现精神沉闷，活动减少，体质量降低，被毛粗糙，摄食和饮水量明显下降，呼吸短促明显，鼻部出现脓性分泌物，以造模后7～10天最为明显。所有实验小鼠均未死亡。
2.2 各组小鼠肺组织病理改变比较 在光镜下观察，正常组:气管管壁无水肿、充血现象，肺泡的间隔没有增宽，血管无扩张充血，未见明显的炎性浸润现象。温燥组:病变区可见肺泡水肿，肺泡隔增厚与炎性细胞浸润，严重的伴明显肺气肿现象，肺泡隔处可显著观察到淋巴、中性粒细胞浸润，呼吸膜明显增厚。MP感染组:病变的区域出现了血管扩张充血，肺泡间隔明显增宽，间质水肿并同时伴有大量的炎性细胞浸润；气管管壁及其周围间质明显充血水肿，并伴有炎性浸润，肺泡腔中有渗出液，见图1。
注: A 为正常组；B 为温燥组；C 为MP 感染组。箭头为炎性细胞浸润
图1 各组小鼠肺组织病理改变图(HE，×40)
2.3 各组小鼠肺组织病理评分比较 表1示，温燥组与MP 感染组的小鼠肺组织积分均于造模后第3天开始增加，到第7天达到观察时间点的最值，然后第10天、第14天依次逐渐减小，且两组之间比较，差异无统计学意义( P>0．05)。
表1 各组小鼠肺组织病理评分比较 （x±s，分）
注：温燥组与MP感染组比较,*P>0.05
2.4 各组小鼠肺组织AQP5 阳性表达情况比较 表2示，与正常组比较，温燥组与MP 感染组小鼠肺组织AQP5 阳性表达率均下降，且均具有统计学意义(P<0.01)；温燥组与MP 感染组的表达率均从造模后第3天开始下降，到第7天、第10天达到观察时间最小范围，然后于第14天回调； 然而温燥组与MP 感染组比较，差异无统计学意义( P>0.05)。
表2 各组小鼠肺组织AQP5阳性表达情况 （x±s）
注：与正常组比较，*P<0.01；MP感染组与温燥组比较，△P>0.05
2.5 各组小鼠肺部病理表现比较 经SP 处理后，光镜下可见AQP5 蛋白阳性表达多位于肺泡膜缘部位，为棕色颗粒状。其炎症表现与光镜下病理改变类似，见图2。
注: A 为正常组； B 为温燥组； C 为MP 感染组。箭头所示棕黄色颗粒为AQP5 阳性表达，正常组颜色普遍偏深，模型组较浅； 箭头为炎性细胞浸润
图2 各组小鼠肺组织AQP5 表达图( 免疫组织化学，×200)
2.6 各组小鼠肺组织AQP5 mＲNA 表达情况比较 表3示，与正常组比较，温燥组与MP 感染组小鼠AQP5 mＲNA 表达均下降，且比较具有统计学意义(P<0.01)；温燥组与MP 感染组的表达率均从造模后第3天开始下降，到第7天、第10天达到观察时间最小范围，然后于第14天回调； 然而温燥组与MP 感染组比较，差异无统计学意义( P >0.05)。
表3 各组小鼠肺组织AQP5 mRNA表达情况 （x±s）
注：与正常组比较，*P＜0.01；MP感染组与温燥组比较，△P＞0.05
2.7 各组小鼠肺组织AQP5 蛋白表达情况比较 表4 显示，与正常组比较，温燥组与MP 感染组小鼠肺组织AQP5 蛋白表达均下降，且均具有统计学意义(P<0.01)；温燥组与MP 感染组的表达率均从造模后第3天开始下降，到第7天、第10天达到观
察时间最小范围，然后于第14天回调； 然而温燥组与MP 感染组比较，差异无统计学意义( P>0.05) 。
表4 小鼠肺组织AQP5蛋白表达情况（x±s）
注：与正常组比较，*P＜0.01；MP感染组与温燥组比较，△P＞0.05
3 讨论
MP 通过飞沫传播侵入机体，由上呼吸道逐渐向下呼吸道蔓延，临床出现畏寒、发热、鼻塞、流涕、咽痛、乏力、头痛、全身不适等症状。咳嗽是其突出表现，一般于病后2 ～ 3天开始，初为干咳，无痰或少痰； 后转为顽固性剧咳，痰液黏稠，偶带血丝，甚至可出现百日咳样痉咳，肺部体征多不明显； 发热等全身症状消失后，刺激性干咳还能持续2 ～ 4 周。整个病程中，干咳是其特征性症状，恰如燥邪伤肺，肺失肃降之干咳，这为MP 感染从燥论治提供了理论依据[7]。
喻嘉言曰: “燥气先伤上焦华盖”，因“燥胜则干”，故可引起肺部津液失于布输，导致肺失通调，以至肺泡内细胞的内外液体传输失于稳态，可引起肺部炎症改变，与其转运相关的AQP5 蛋白表达下降[1]。AQP5 属于13 种细胞膜整合蛋白亚家族一员，水通道蛋白( AQP) 广泛分布于肺、肾和消化系统器官中，是一组非选择性细胞膜转运蛋白，能介导水的快速跨膜运动。AQP 表达可作为肺津代谢的分子生物学基础之一，其中AQP5 位于I 型肺泡上皮细胞、气道上皮表面及黏膜下腺细胞顶膜，其主要作用是参与和维持气血屏障和细胞内外水分的平衡和调节，其表达量减少是I 型肺泡上皮细胞损伤的特异性指标[8]，AQP5 的表达改变及功能异常与肺部感染、慢性阻塞性肺疾病、肺癌、哮喘、肺水肿等多种疾病的发病有关[9]。本实验研究结果显示，与正常组比较，温燥组和MP感染组小鼠的肺组织AQP5 的阳性表达率、AQP5 mＲNA 的表达量及AQP5 蛋白的表达量较正常组均明显降低，且都有统计学意义(P<0.05) ，且于观察时间点造模后第3天开始下调，于第7天、第10天达到低值范围，于第14天开始回调，同期光镜下观察到温燥组和MP 感染组小鼠肺组织均有肺泡水肿与肺泡隔增厚以及炎性细胞浸润表现，且病理积分呈现与第3天开始升高，到第7天、第10天达到最高范围，继而第14天开始下降，与病理表现于第3天开始炎症改变加重，第7天、第10天改变最为明显，第14天开始恢复改变同步。不同检测方法一致性提示温燥条件下和MP 感染后均能引起肺组织AQP5 表达的下调，这与外燥伤肺，与肺部AQP5蛋白表达下降的结论一致[1]。该实验另一结果显示温燥组和MP 感染组小鼠之间AQP5 的表达及病理积分于第3天、第7天、第10天、第14天对比之下均无统计学意义(P>0.05) ，且变化呈一致性，表明温燥伤肺和MP 感染后，小鼠肺部组织AQP5 的表达均下调，且存在着相关性； 温燥组于第10天后AQP5 的表达开始回调，可能跟小鼠对温燥的环境适应有关； MP 感染组于第10天后AQP5 的表达开始回调，可能跟小鼠肺炎相应时间内可自愈有关。由此温燥伤肺与MP 感染引起的肺部炎症可能存在一定的相关性，这可为从燥论治MP 感染提供了实验依据及生物学指标，但其具体作用机制待进一步深入研究。
参考文献:
[1]张六通,丁建中,李军川,等.外燥对小鼠肺组织水通道蛋白5表达的影响及意义[J].湖北中医学院学报,2010,12(1):3-5.
[2]吴振起,刘光华,岳志军,等.清燥救肺汤抗肺炎支原体感染大鼠作用的实验研究[J].中国中西医结合儿科学,2013,(1):1-4+97.
[3]丁建中,龚权,张六通,等.温燥致病机制的实验研究[J].中医杂志,2007,48(11):1024-1026.
[4]刘晓红,辛德莉,侯安存,等.小鼠肺炎支原体肺炎模型的建立及组织病理学评分方法的应用[J].重庆医学,2004,33(9):1338-1340.
[5]丁建中,倪圣,张六通,等.桑杏汤对温燥模型小鼠肺呼吸膜超微结构、表面活性物质及炎性细胞因子的影响.中医杂志,2016,57(12):1057-1060.
[6]向少伟,王小琴,唐庆.肾安提取液对糖尿病小鼠肾脏TGF-β1表达的影响[J]. 中华中医药杂志,2011,26(8):828-833.
[7]吴振起,刘光华,王雪峰.从燥论治肺炎支原体感染[J].中医杂志,2012,53(21):1879-1880.
[8]刘笑玎,原铭贞,王司仪,等.水通道蛋白1、3、4和5与急性肺损伤关系的研究进展[J].吉林大学学报(医学版),2014,40(5):1119-1122.
[9]刘魁,彭文鸿.水通道蛋白5与肺疾病相关研究进展[J].临床肺科杂志,2012,17(11):2064-2066.
基金项目：国家自然科学基金项目（编号：81373687）；
作者简介：吴振起（1974-），男，辽宁庄河人，医学博士，主任医师，博士后。
通信作者：马融， E-mail：mr1974@163.com